abts配制_配好的as最多可放置多久

2024-10-30 16:32:38 139

1.有谁对ELISA试剂盒了解

2.elisa步骤

3.血清TnI和TnT详细资料大全

4.求助，ABTS溶液的配置问题

5.酶联免疫法的注意事项

6.一抗孵育时间，不能超过多久

ABTS+测抗氧化性原理是通过漆酶氧化ABTS的速率来决定漆酶酶活力的大小。

,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，如果与过二硫酸钾反应，可以生成绿色的ABTS自由基。该自由基在734nm有最大吸收，所以，通过检测734nm的吸光度，可以测定的其浓度。

一个物质加入到ABTS自由基溶液后，如果734nm的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性，属于抗氧化剂。该法称为ABTS自由基清除法，可以用评价植物（或中草药抽提物）、纯化合物的抗氧化能力的。

此外，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。

扩展资料

以ABTS（7mmol, 10 equiv.）+K2S2O8(4.9mmol, 7

equiv.)的水溶液按1:1的体积比混合，避光情况下储存12-16h，第二天以乙醇稀释40-60倍，摇匀，静置5min，放入比色皿中测734nm的吸光度（0.7左右）。

测试吸光度随时间变化关系，时长为30min，发现吸光度有很明显的下降，30min大概降到0.45左右，换做水稀释时，吸光度下降更为严重，30min大概降到0.15左右。后面要测特定物质湮灭自由基的能力，这种情况势必严重干扰结果。

不过，ABTS自由基的生成需要过二硫酸钾氧化，所以，是一个混合物。而且，反应通常需要12小时，比较耗时。用PTIO自由基替代ABTS自由基进行实验，取得不错的实验结果。PTIO自由基不需要氧化，可以现成的化学品溶于水配制，另外，由于反应是在水溶液或者缓冲液中进行，具有更强的生物相关性。

百度百科-ABTS

有谁对ELISA试剂盒了解

酶联免疫诊断试剂盒（上海科华的试剂盒）的底物A就是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）,底物B就是显色剂B（含TMB）,用于显色。另外，常用的底物还有：1）AP的底物，常用的为对-硝基苯磷酸脂（PNP），其反应物为**的对硝基酚，测读波长为405nm2）GOD的底物，为葡萄糖，供氢体为对硝基蓝四氮唑，反应产物为不溶性的蓝色沉淀什么是TMB？TMB即四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，

且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。

TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。

由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试

剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等

优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈

**，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。

ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所用。

elisa步骤

（一）ELISA测定技术的发展

然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。一、Elisa试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。 1、基因工程试剂对免疫测定技术发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。 HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。可测得HBsAg变异样品。提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml elisa试剂盒的用途测试剂盒检测原理 ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性

[编辑本段]（二）操作步骤

方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 ↓ 加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照） ↓ 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml， 37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 ↓ 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

[编辑本段]（三）试剂器材

1. 试剂（1）包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）: NaHCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克加蒸馏水至1000ml （2）洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml （3）稀释液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1克加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。（4）终止液（2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。（5）底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）: 0.2MNa2HPO4（28.4克／L）25.7ml 0.1M柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸馏水50ml。（6） TMB（四甲基联苯胺）使用液: TMB（10mg／5ml无水乙醇）0.5ml 底物缓冲液（PH5.5） 10ml 0.75％H2O2 32μl （7） ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl （8）抗原、抗体和酶标记抗体。（9）正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: （1）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。（2）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。（3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。

血清TnI和TnT详细资料大全

　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现阴性结果。

（三）间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

（五）捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

（六）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素（streptidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酶或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。

求助，ABTS溶液的配置问题

血清TnI和TnT指的肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI），是组成肌钙蛋白的两个亚基。

概述,别名,医学检查,检查名称,分类,化验取材,原理,试剂,操作方法,正常值,化验结果意义,相关疾病, 概述肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，由三个结构不同的亚基组成，即肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI）和肌钙蛋白C（TnC），它附在收缩的横纹肌细微组织上，TnI是一种结构蛋白，它与肌动蛋白及原肌球蛋白互相作用。TnI与肌动球蛋白在静止状态时相结合，抑制肌动球蛋白的ATP酶（ATPase）活性。TnC有四个能结合钙离子的结合点，当它与细胞内的钙离子结合时，能导致整个肌钙蛋白构造上的变化。肌钙蛋白放松了肌动球蛋白，让肌动球蛋白与肌浆球蛋白互起作用，而造成肌肉收缩。肌钙蛋白具有的3种同分异构体，其中两种同分异构体是骨骼肌所特有的，一种同分异构体是心肌所特有的，这3种肌钙蛋白的同分异构体存在着结构上的差异。心肌中的T和I亚基结构不同于其他肌肉组织，心肌钙蛋白T、I（CTnT、CTnI）由于分子量小，分别为37000D和24000D，所以发病后血中浓度迅速升高，目前已得到抗CTnT和CTnI的特异抗血清，套用免疫层析与酶免技术可进行快速检测与定量测定，具有快速、灵敏、特异等特点。别名 TnI；TnT 医学检查检查名称血清TnI和TnT 分类血液生化检查 > 蛋白质测定化验取材血液原理（1）心肌钙蛋白T、I的快速检测：套用免疫层析方法测定样品中的特异抗原（CTnT、CTnI）。测试时滴加血清样品于样品槽，样品通过毛细管效应沿试纸膜运动，如果样品中含有特异抗原，试验部位就出现色带，在对照区域内应该有另一颜色条带作为实验对照。（2）心肌钙蛋白T的ELISA法测定：生物素与亲和素作用下的双抗体夹心ELISA，用链霉亲和素-生物素化的抗TnT单克隆抗体作包被物，依次于样品中TnT抗原和酶标TnT单克隆的抗体反应，然后加入底物色原。酶催化底物显色，由系列TnT标准制定的标准曲线，定量测定CTnT含量。试剂（1）心肌钙蛋白T、I的快速检测：CTnT免疫层析试纸条（德国宝灵曼公司专利）。 CTnI免疫层析试纸条（进口）。（2）心肌钙蛋白T的ELISA法测定： ①生物素-亲和素CTnT单克隆抗体包被板。 ②孵育缓冲液。 ③浓缩洗涤液。 ④酶标结合物。 ⑤CTnT标准品。 ⑥底物色原：ABTS（二氨2，2叠氮）。操作方法（1）心肌钙蛋白T、I的快速检测： ①将包装纸打开，标记上样品编号。 ②加5～6滴血清样品到样品槽中。 ③在10～15min内观察色带出现情况。附注： ①试纸条只能用1次，重复使用无效。 ②试纸条试验区和对照区均不出现色带，取另一试纸条重复检测仍无结果，则表示试纸条失效。 ③免疫层析技术测定CTnT、CTnI适合床边快速试验，但只是定性或半定量，要真正了解病情严重程度及选择治疗措施还需定量测定。（2）心肌钙蛋白T的ELISA法测定： ①在包被板中分别加入标准血清，对照血清和病人标本于相应的孔内各50μl。 ②每孔各加孵育缓冲液50μl，并轻轻混匀。 ③室温下孵育60min后洗涤三次，10min内完成。在吸水纸上用力拍打微孔。以除去残留水滴。 ④每孔各加入酶结合物100μl，轻轻混匀。 ⑤倒空微孔板中的孵育液，用洗涤液将微孔洗三次，在吸水纸上用力拍打微孔，以除去残留水滴。 ⑥将200μl色原底物溶液加入相应的孔中，避光，轻轻混匀，静置30min。 ⑦用酶标仪在10min内，于405nm和630nm双波长下测定吸光度值（OD值）。附注： ①CTnT待测标本最好用血清，不要用抗凝血浆，因为抗凝剂如：肝素、EDTA等对CTnT有影响。 ②由于CTnT是心肌细胞损伤释放出来的，所以尽量避免标本溶血，如果标本溶血很可能造成检测结果增高。 ③配制好孵育液不要冷冻保存，应放在2～8℃冷藏。 ④实验前应注意试剂有无失效，如变质，其颜色加深。 ⑤为了提高CTnT检测的可靠性，应注意加样的准确及其他操作过程，比色最好选用双波长。正常值干片法：TnI阴性免疫法：TnT0～0.15μg/L 。化验结果意义升高：心肌缺血损伤，如心肌梗死、急性心绞痛、不稳定型心绞痛、心脏手术后等。心肌损伤后、血中出现TnI、TnT时间最早、持续时间长，因此TnI、TnT是心肌损伤的一个较特异和较灵敏的指标，TnI较TnT更敏感。（1）急性心肌梗死（AMI），发病后血中浓度很快增高，GTnT、CTnI，3～6h超过参考值上限值，GTnT 10～24h达峰值，10～15天恢复正常。CTnI 14～20h达峰值，5～7天恢复正常。即出现早，和CK-MB相当或稍早；消失慢，持续时间超过LD1，诊断的视窗期特别长，兼有CK-MB和LD1的优点。灵敏度GTnT为50%～59%（0～6h），CTnI为6%～44%；特异性GTnT为74%～96%，CTnI为93%～99%。据报导GTnT在诊断AMI时比CK-MB更为灵敏，但有报导在肾脏疾病病人血样中发现GTnT，所以特异性较差。GTnT比LD1/LD2比率在诊断AMI中更为灵敏，且在肾病及其他疾病患者血液中未发现CTnI，所以CTnI是心脏受损时唯一的特异性标志物。由于GTnT和CTnI消失慢，所以，可作为心肌梗死后期标志物。（2）GTnT和CTnI可作为心脏手术中心肌梗死症状出现的指示物，当病人接受动脉搭桥手术时，若GTnT和CTnI含量增加，表明出现心肌梗死，而此时CK-MB含量并无变化。相关疾病急性心肌梗死

酶联免疫法的注意事项

ABTS

中文名：2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐

别名：2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)

分子式：C18H24N6O6S4 分子量：548.68

ABTS的配制

试剂一：0.0384gABTS定容到10mL

试剂二：0.0134g过硫酸钾定容到10mL

试剂一与试剂二1：1混合

12h避光后得 ABTS工作液

使用之前以pH7.4的PBS稀释20倍

一抗孵育时间，不能超过多久

⒈　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

⒉　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：

⑴　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。

⑶　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

⑷　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

一、一抗孵育时间，不能超过多久

1、一抗的定义

一抗指的是能够和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白，也就是平常所说的抗体。二抗指的是能和抗体结合的抗体，主要用于检测抗体的存在，放大一抗的信号。

2、一抗的孵育时间

（1）一抗的孵育时间与温度，抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。

（2）如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

二、双抗体夹心法检测未知抗原

1、包被

用0.05M碳酸盐包被缓冲液（ph9.6）对抗体进行稀释，直至蛋白质含量为1-10?g/ml为止。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。第二天的时候，去掉孔内溶液，然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2、加样

将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中，在37℃的环境条件下孵育1小时，然后进行洗涤。